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當前位置:首頁 > T細胞治療研究解決方案 > SMART全長cDNA合成&文庫構建

 
T細胞治療研究解決方案
 
使用轉基因T細胞(T淋巴細胞)來靶向治療癌癥是一種很有前景的方法,特別是對于難以使用傳統方法來治療的癌癥。最為常見的兩種方法圍繞著在基因工程T細胞中引入新的T細胞受體(TCR)或嵌合抗原受體(CAR)(Humphries 2013)來開展。
過繼性T細胞療法的工作流程主要包括以下幾大步:從病人體內分離T細胞,在體外對這些T細胞進行基因改造,然后將改造后的T細胞回輸至病人體內。除了這種被稱作自體同源的方法之外,全世界的一些公司正致力于開發一種可以從單一供體生產,然后用于治療數千名患者(異體同源方法)的治療方法。在這兩種方法中,T細胞改造都是在患者體外進行的(體外基因治療)。在T細胞改造方面,Takara可以為您提供較為完善的解決方案,助力T細胞治療研究。
 
 
 
1. TCR/scFv調?。篠MARTer RACE 5’/3’ Kit
 
SMARTer RACE 5’/3’Kit使用SMARTer技術進行RACE (Rapid amplification of cDNA ends),無需接頭連接即可合成cDNA。所合成的cDNA可直接用于5’ RACE PCR或者3’ RACE PCR,因此抗體可變區等可通過簡便的操作流程來進行克隆。該方法已在T細胞治療中有所應用,并且在T細胞/B細胞相關研究中的使用頻率也越來越高。
 
· Dossa RG., et al. (2018) Development of T-cell immunotherapy for hematopoietic stem cell
   transplantation recipients at risk of leukemia relapse. Blood. 131(1):108-120.
· Arai Y., et al. (2018) Myeloid Conditioning with c-kit-Targeted CAR-T Cells Enables Donor Stem
   Cell Engraftment. Mol Ther. 26(5):1181-1197.
· Su S., et al. (2017) Blocking the recruitment of naive CD4+ T cells reverses immunosuppression
   in breast cancer. Cell Res. 27(4):461-482.
· Benjamin Y. Jin, et al. (2018) Engineered T cells targeting E7 mediate regression of human
   papillomavirus cancers in a murine model. JCI Insight. 2018 Apr 19; 3(8): e99488.
 
2. CAR/TCR載體構建:In-Fusion HD Cloning Plus
 
In-Fusion HD Cloning Plus技術通過加速抗原及CAR載體的構建,加速了T細胞基因改造流程。In-Fusion HD克?。嚎焖?(15 min), 高效(克隆效率>95%), 無序列依賴 (任何PCR插入片段都可以克隆到任意載體的任意位點), 無縫(靶標抗體不會加入任何額外堿基對或者氨基酸), 定向, 高通量(HTP)。
由于高克隆效率和高準確度,多項研究中使用In-Fusion HD 克隆技術進行抗體片段高通量克隆(Spidel et al. 2016; Chen et al. 2014; Meng et al. 2015)。
 
· Yi Z., et al. (2018) Optimizing EphA2-CAR T Cells for the Adoptive Immunotherapy of Glioma.
   Mol Ther Methods Clin Dev. 2018 Feb 2;9:70-80.
· Hale M., et al. (2017) Homology-Directed Recombination for Enhanced Engineering of Chimeric
   Antigen Receptor T Cells. Mol Ther Methods Clin Dev. 2017 Jan 10;4:192-203.
· Shum T., et al. (2017) Constitutive Signaling from an Engineered IL7 Receptor Promotes Durable
   Tumor Elimination by Tumor-Redirected T Cells. Cancer Discov. 2017 Nov;7(11):1238-1247.
· Tashiro H., et al. (2017) Treatment of Acute Myeloid Leukemia with T Cells Expressing Chimeric
   Antigen Receptors Directed to C-type Lectin-like Molecule 1. Mol Ther. 2017 Sep 6;25(9):2202
   -2213.
 
 
3. 慢病毒成功轉導:Lenti-X Titration and Concentrator kits
 
目前有多種載體用于TCR-T/CAR-T細胞制備,已開展的臨床試驗以病毒載體轉導的方式為主,而以非病毒載體轉導的方式也逐漸受到青睞。
合適的病毒滴度是慢病毒成功轉導的關鍵因素。Lenti-X Titration kits可提供p24 ELISA、qRT-PCR和GoStix三種慢病毒滴度測定方法,耗時僅需4小時-10分鐘,更為快速高效,輕松加速T細胞制備;Lenti-X Concentrator可輕松濃縮慢病毒滴度,不需要特殊設備。
 
4. 增強慢病毒轉導T細胞:GMP Grade RetroNectin
 
在過繼性T細胞療法中,為了有效地將TCR / CAR基因引入T淋巴細胞中,高轉導效率是至關重要的。RetroNectin GMP級試劑可用于增強病毒轉導和擴增幼稚T細胞群,該產品已在全球44個機構中用于超過68種基因治療臨床試驗方案。
美國國立衛生研究院Steven Rosenberg博士研究組、紀念斯隆凱特琳癌癥中心、日本三重大學醫院在進行相關疾病臨床研究過程中,都使用了RetroNectin GMP級試劑進行了T細胞轉導,眾多其它臨床研究使用文章也已發表。
 
5. CRISPR/Cas9基因編輯:Guide-it Gene editing products
 
CRISPR/Cas9基因組編輯是其中一種非病毒載體轉導方式,在癌癥免疫治療中已展示出了令人樂觀的結果,可用于破壞癌癥細胞免疫逃逸機制。Kagoya et al., 2018報道抑制DOT1L可減輕異體T細胞反應。在這篇文章中作者使用Guide-it sgRNA In Vitro Transcription KitGuide-it Recombinant Cas9制備了Cas9-sgRNA核糖核蛋白(RNP)復合物,通過電轉RNP復合物的方式,敲除了CAR-T細胞中的若干內源性TCRs,其敲除效率可達到~30%。
 
另外,Nature雜志發表了一項開創性研究,Roth et al.,2018描述了一種高效的T細胞基因改造方法,通過將Cas9-sgRNA RNP復合物與雙鏈DNA或單鏈DNA HDR模板(使用了Guide-it Long ssDNA Production System制備單鏈DNA)共電轉,不僅可規避病毒傳遞,而且可最大限度地減少細胞毒性。
 
 
用戶講座: 如何選擇合適的HDR模板 點擊查看>>
主講人:Theo Roth,MD/PhD student at UCSF
 
 
6. T細胞受體NGS分析:SMARTer immune profiling kits
 
免疫基因組學應用于癌癥研究的一個挑戰就是在癌癥患者接受免疫治療之前和之后,確定T細胞庫并鑒定腫瘤反應性T細胞克隆 (Liu et al. 2017)。SMARTer immune profiling kits利用SMART技術和基于5'-RACE的方法來捕獲TCR轉錄本完整V(D)J可變區,提供批量細胞、單細胞及高通量單細胞等多種T細胞受體(TCR)的NGS分析解決方案。
 
· SMARTer Human TCR a/b Profiling Kit
   以總RNA或純化后細胞為起始進行分析。
· SMARTer Human scTCR a/b Profiling Kit
   可以完全捕獲TCR-α和TCR-β可變區,
   確定單個T細胞內TCR α/β鏈配對信息。
· SMARTer ICELL8 human TCR a/b profiling
   可在高通量單細胞平臺SMARTer ICELL8 cx
   系統上輕松捕獲TCR轉錄本完整V(D)J可變區。
 
 
 
 
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